▎使用方法：
试剂准备
| 试剂名称 | 试剂准备 |
Working Label Mix Red*
DAPI (1×) TritonX-100 (0.3%) 1×Equilibration Buffer 1×DNase I Buffer Tissue Autofluorescence Quencher# |
用 Probe Diluent 将 Label Mix Red 稀释 25 倍得到 Working Label Mix Red。 用 PBS 将 DAPI (500×)稀释成 DAPI (1×)。 用 PBS 将 100% TritonX-100 稀释成 0.3% TritonX-100。 用去离子水将 5×Equilibration Buffer 稀释成 1×Equilibration Buffer。 用去离子水将 10×DNase I Buffer 稀释成 1×DNase I Buffer。 能够显著淬灭脂褐素引起的自发荧光。 |
* 未用完的 Working Label Mix Red 于-20℃避光分装保存 3 个月，避免反复冻融。
# 使用完后拧紧瓶盖防止挥发。
样本处理
1. 对于贴壁细胞（通过荧光显微镜分析）
(1) 将细胞爬片放入细胞培养板中，接种细胞进行培养，至少 24 h。通过所需方法诱导细胞凋亡， 同时培养无诱导的对照组细胞。
(2) 除去培养基，在室温下用 50 µL 4%多聚甲醛固定细胞 30 min。
(3) 除去固定液并用 200 µL PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。
(4) 固定后，每孔添加 50 µL 0.3% Triton X-100，并在室温下孵育 30 min。
(5) 除去通透剂，用 50 µL BSA Working Solution 洗涤细胞 2-3 次，用 1mL PBS 洗涤细胞 2-3 次。进行荧光显微镜分析（详细分析方法参考下方 TUNEL 分析）。
注意：
1) 对于细胞爬片及其他孔板细胞，可依据实际情况调整固定液和通透剂体积。
2) 可在第(5)步后通过用 DNase I 处理样本引起 DNA 断裂来制备选做的阳性对照。阳性对照的设置，样本制备完成后，在室温条件下可用 10 U/mL 的 DNase I（按 1：500 的比例，用 1×DNase I Buffer 将 5 U/µL 的 DNase I 稀释成 10 U/mL）消化细胞或组织 10-20 min 后， 样本用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，然后再进行荧光显微镜分析，如果是组织切片样本，建议阳性对照后续操作在单独的染色缸中染色和洗涤。
2. 对于非贴壁细胞（通过流式细胞仪分析）
(1) 培养细胞至最佳密度（约 1-2×10 6细胞/mL），通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
(2) 以 300 g 离心并收集细胞（1-5×10 6），用 PBS 洗涤 2 次。
(3) 加入 1 mL 4%多聚甲醛，在室温下孵育 30 min。
(4) 以 300 g 离心细胞，除去上清液，重悬于 1 mL PBS 中，重复洗涤 2 次。
(5) 以 300 g 离心细胞，除去上清液，在室温下，用 500 µL 0.3% Triton-X 100 重悬细胞 5 min 使其通透（或者将细胞在 100 µg/mL 蛋白酶 K 的 PBS 中重悬 5 min 使其通透）。
(6) 以 300 g 离心细胞，除去上清液，重悬于 1 mL PBS 中。重复洗涤 2 次，然后进行流式细胞仪分析（详细分析方法参考下方 TUNEL 分析）。
注意：可在第(6)步后通过用 DNase I 处理样本引起 DNA 断裂来制备选做的阳性对照。DNase I 处理的详细步骤可参考贴壁细胞样本处理中的注意事项 2)。
3. 对于石蜡包埋的组织切片（通过荧光显微镜分析）
(1) 将组织在二甲苯浸泡 2 次，每次 10-20 min 进行脱蜡。
(2) 通过以下步骤（按给定顺序）为组织复性：在 100%乙醇中 2 次洗涤，每次 5 min，然后依次在 95%，70%和 50%乙醇中各洗涤 1 次，每次 3 min。
注意：也可按自己实验室组织脱蜡、复性体系进行操作。
(3) 用适量的 PBS 浸洗样品 2 次，每次 5 min。
(4) 排出组织中多余的 PBS，切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈，并在 20 µg/mL Proteinase K（在 PBS 中，现配现用）溶液中室温孵育 8-10 min，100-200 µL Proteinase K 溶 液覆盖住组织即可。
注意：必须针对特定组织类型和厚度优化蛋白酶消化时间。蛋白酶过度消化将导致细胞结构丧失， 组织切片可能会从玻片上脱落。消化不充分会导致 TdT 标记不彻底。
(5) 用适量的 PBS 浸洗样品 3 次，每次 5 min 来终止 Proteinase K 消化作用，进行荧光显微镜分析（详细分析方法参考下方 TUNEL 分析）。
注意：可在第(5)步后通过用 DNase I 处理样本引起 DNA 断裂来制备选做的阳性对照。DNase I 处理的详细步骤可参考贴壁细胞样本处理中的注意事项 2 )。
4. 对于冰冻组织切片（通过荧光显微镜分析）
(1) 将切片在玻片上干燥后，在室温下用 200 µL 4%多聚甲醛固定 30 min。
(2) 用适量的 PBS 浸洗 2 次，每次 5 min。
(3) 去除组织中多余的 PBS，切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈，并在 20 µg/mL Proteinase K（在 PBS 中，现配现用）溶液中室温孵育 8-10 min，100-200 µL Proteinase K 溶 液覆盖住组织即可。
(4) 用适量的 PBS 浸洗样品 3 次，每次 5 min 来终止 Proteinase K 消化作用，进行荧光显微镜分析（详细分析方法参考下方 TUNEL 分析）。
注意：
1）组织切片会产生自发荧光，可使用组织自发荧光淬灭剂进行处理。
2）可在第(4)步后通过用 DNase I 处理样本引起 DNA 断裂来制备选做的阳性对照。DNase I 处 理的详细步骤可参考贴壁细胞样本处理中的注意事项 2)。
TUNEL 分析
1. 荧光显微镜分析
(1) 根据要分析的样品数量，在使用前准备 TdT 标记反应缓冲液：
| 反应组分 | 每孔体积（μL） |
去离子水 Equilibration Buffer (5×) Working Label Mix Red TdT Enzyme 总体积 |
33 10 5 2 50 |
注意：配制 TdT 标记反应缓冲液之前，将各组分平衡至室温，Equilibration Buffer (5×)母液因低温保存，会出现少量成分析出的现象，请颠倒混匀后使用，可最后加 TdT Enzyme。Equilibration Buffer (5×)中含有高毒性化学物质二甲胂酸钠和氯化钴，皮肤接触后，立即用大量水冲洗。万一 发生事故或感到不适，请立即就医。使用时请勿饮酒，饮食或吸烟。
(2) 向每个样品中加入 50 µL（96 孔板推荐 50 µL，24 孔板推荐 200 µL，切片建议添加 50-200 µL，可依据样本特性及面积大小适当调整试剂体积，覆盖住组织即可）1×Equilibration Buffer， 室温避光孵育 5 min。
(3) 除去 1×Equilibration Buffer，向每个样品中加入 50 µL（96 孔板推荐 50 µL，24 孔板推 荐 200 µL，切片建议添加 50-200 µL，可依据样本特性及面积大小适当调整试剂体积，覆盖住组 织即可）反应混合物，并在湿盒中 37℃下避光孵育 1-2 h (不同的样本，可视情况调整孵育时间)。
注意：湿盒底部需要加入适量超纯水以在孵育过程中保持湿润，从而尽量减少 TUNEL 检测液的蒸发。
(4) 用 PBS 将样品浸洗 3 次，每次 5 min。
(5) 用 1×DAPI 孵育 10 min 对样品进行复染。
注意：如需计算凋亡细胞比例，建议复染，根据染色组织的不同，复染浓度可能需要调整。DAPI 过度染色可能导致难以观察荧光素标记。
(6) 用适量的 PBS 浸洗样品 3 次，每次 5 min。
(7) 组织自发荧光淬灭，对于组织样本，添加 Tissue Autofluorescence Quencher 室温避光孵 育 5 min，去离子水浸洗 5 min 后 PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。
注意：
1.组织切片会产生自发荧光，仅组织样本需要淬灭自发荧光，Tissue Autofluorescence Quencher 处理后组织会染成蓝色，也会一定程度降 Tunel 的荧光强度，但不影响荧光显微镜拍 照；2.需精确组织自发荧光淬灭剂的孵育时间，可在第一个样本添加 Tissue Autofluorescence Quencher 后开始计时 5 min；3.Tissue Autofluorescence Quencher 易挥发，在孵育过程中， 需要及时补添，以免试剂变干凝固结块，影响后续拍照观察。
(8) 对于细胞爬片，可在载玻片上滴加水性封固剂或抗荧光淬灭剂，盖上贴有细胞的盖玻片封片， 对于石蜡切片和冰冻切片等样本，可滴加水性封固剂或抗荧光淬灭剂于组织切片上，封住盖玻片封 片，用荧光显微镜进行观察。对于孔板、培养皿内细胞样本，加入适量 PBS 浸没细胞，再进行荧 光显微镜拍照观察。红色通道（Ex/Em=555 nm/565nm）。
显微镜拍照技巧：
1）使用 DAPI 通道查找细胞位置；
2）阴性对照组优先拍照，阴性对照显示荧光为非特异性染色荧光，需要通过黑白平衡进行扣除至无荧光；
3）实验组或阳性组拍照，扣除与对照相同的黑白平衡，得到实验组或阳性组有效荧光。
2. 流式细胞仪分析
(1) 将细胞重悬于 100 µL 1×Equilibration Buffer 中，在室温下避光孵育 10 min。
(2) 300 g 离心细胞，除去上清液，重悬于 50 µL TdT 标记反应缓冲液中，在 37℃下孵育 1-2 h (不同的样本，可视情况调整孵育时间)，孵育期间可定时轻轻地晃动以混匀细胞。
(3) 300 g 离心细胞。除去上清液，重悬于 1 mL PBS 中。重复洗涤 2 次。
(4) 重悬于 200 µL 1×DAPI 中，孵育 10 min。
(5) 通过流式细胞仪分析细胞。
▎注意事项 ：
1. 请按照试剂盒各组分推荐温度储存，避免反复冻融。
2. 实验过程中务必防止样本干片（尤其是组织切片），干片会导致强烈的非特异性背景染色。
3. 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。
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