▎实验流程 ：
1. PVDF膜激活
转膜缓冲液中的醇（甲醇、乙醇）具有两个重要功能；它稳定了凝胶的尺寸并从蛋白质分子中剥离复合的十二烷基硫酸钠（SDS）, 改善蛋白质与膜的结合。
优先选择甲醇场景：
1需要检测小分子量蛋白（<20 kDa）：甲醇的强收缩性可更好防止蛋白穿透；
2使用含甲醇的传统转膜液（如Tris-甘氨酸缓冲液）；
3追求最高结合效率（如痕量蛋白检测）。
优先选择乙醇场景：
1实验室安全要求高转膜对象为大分子量蛋白（>100 kDa）：温和收缩减少膜孔堵塞风险；
2使用无甲醇转膜液；
3实验室安全要求高。
2. 蛋白免疫印迹检测方法
蛋白质通常可以通过两种常见的电转移方法转移到 LeanV PVDF 转印膜上：湿转和半干转。下面表格描述了两种方法的区别和差异：
| 转移方法 | 湿转 | 半干转 |
条件 缓冲液体积 转印时间 运行 凝胶平衡时间 典型连续缓冲液名称/组成 所需缓冲系统 典型的不连续缓冲液名称/组成
醇百分比 SDS 百分比
|
浸泡在缓冲液中的膜凝胶组 0.5L或更高，具体取决于转膜系统 慢（1 h或更久） 恒压或恒流 非必须 Towbin缓冲液, pH 8.3, 25 mM Tris, 192 Mm甘氨酸 连续（单个缓冲器） N/A
10-20% 0.0-0.05% | 滤纸浸湿缓冲液 每个小凝胶约 0.05L 快（7-45 min） 恒流 每个凝胶平衡至少15min Bjerrum Shafer Nielsen 缓冲液, pH 9.2, 48 mM Tris, 39 mM甘氨酸 连续（单个缓冲器）或不连续（3个缓冲区） 阳极缓冲液I:300mM Tris, pH 10.4, 阳极缓冲液II:25mM Tris, pH 10.4, 阴极缓冲液:25mM Tris, 40mM 氨基己酸, pH 9.4 10-20% 0.0-0.05% |
湿转：
1 、用甲醇或乙醇浸泡PVDF膜15-30秒，直至膜润湿润透，乙醇多延长15秒。
2 、将膜浸入超纯水中1-2分钟以置换醇。
3 、将膜在转膜缓冲液中平衡2-3分钟或直到准备好使用。
注意：膜被弄湿后，不要让它变干。它可以保存在缓冲液中，直到蛋白质转移。如果膜部分变干，则必须再次润湿（步骤 1-3）
半干转：
1 、将蛋白质混合物分散在聚丙烯酰胺凝胶上。
2 、将凝胶浸入转移缓冲液中，并使其平衡10-15分钟。
3 、根据制造商对所用转移装置的说明组装转移堆。
注意：为了确保均匀转移，请小心地滚动一个干净的移液管或印迹辊覆盖在堆叠中的每一层的表面上。不适用过大的压力，因为这可能会损坏凝胶和膜。
4 、根据转移设备制造商的说明转移蛋白质。
5 、去除转移系统上的印迹，并在超纯水中短暂冲洗膜去除凝胶碎屑。印迹可以风干储存，也可以立即使用用于免疫印迹检测步骤。
注：免疫检测前干燥印迹可能会增强某些蛋白质的结合并减少背景噪声。
3. Western蛋白免疫印迹
材料准备
- LeanV PVDF 转印膜切割成凝胶尺寸
- 甲醇或乙醇酒精用于激活PVDF膜
- 超纯水用于清洗
- 转膜缓冲液：25 mM Tris, 192 mM甘氨酸，pH 7-8, 10%-20%甲醇用于湿转；或 48 mM Tris , 39 mM甘氨酸, pH 9.2, 10%甲醇用于半干式转移。
- 滤纸，切成凝胶的尺寸，用甲醇润湿，并浸泡在转膜缓冲液中至少30 秒
- 封闭缓冲液：商品化快速封闭剂或含有 0.5–5（w/v）封闭剂（牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉）的洗涤缓冲液
- 洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（PBS）或 Tris 缓冲盐水（TBS），含有 0.1- 0.5% Tween®-20 表面活性剂（PBST 或 TBST）PBS:10 mM 磷酸钠，pH 7.2 ，0.9%NaCl TBS ：10mM Tris ，pH 7.4 ，0.9%NaCl
- 一抗（对目标蛋白有特异性）利用商品化抗体稀释液、封闭缓冲液或洗涤液稀释
- 二抗（对一抗特异），用检测酶标记（例如，辣根过氧化物酶[HRP]或碱性 磷酸酶[AP]），在商品化抗体稀释液、封闭缓冲液或洗涤缓冲液中稀释
免疫印迹检测：
以下是 LeanV PVDF 转印膜免疫检测的通用方案。如需获得“完美”蛋白质印迹，某些关键因素，如蛋白质浓度、封闭溶液和抗体浓度可能需要优化。
标准免疫检测：
1 、电转膜前甲醇浸泡15-30s激活PVDF膜, 如果膜已经干燥，则将其重新润湿 15 秒，保持膜润湿。
2 、电转膜后将膜置于封闭缓冲液中，温和搅拌封闭 1 小时。
3 、将膜置于稀释的一抗溶液中，并在温和搅拌下室温孵育 1 小时（或 4℃过夜 孵育）。
4 、用洗涤缓冲液（添加 Tween®-20 表面活性剂的缓冲液（TBST 或PBST））清 洗膜 3-5 次，每次 5 分钟。并利用抗体稀释液、洗涤缓冲液或封闭缓冲液稀释二抗。
5 、将膜置于稀释的酶标记二抗溶液中，室温孵育 1 小时。
6 、用洗涤缓冲液洗涤膜 3-5 次，每次 5 分钟。
7 、将膜放入干净的容器中并加入适当的缓冲液，保持膜的润湿。
8 、根据检测试剂制造商的说明，配制检测试剂。
9 、对于 HRP 或 AP 化学发光试剂，将膜暴露于 x 射线胶片或获取图像使用数 字成像系统。对于显色检测，添加试剂并等待信号出现。
▎注意事项 ：
1. 操作取膜裁膜时一定要戴手套，以免留下指纹。
2. 小心操作，避免划伤薄膜表面，不要折叠膜; 使用钝镊子，以防损坏薄膜。
3. 在切割或处理过程中，保留与薄膜一起的保护纸（蓝纸），但在润湿膜时应丢弃。
4. 疏水性膜（LeanV PVDF）在使用前必须在醇溶液中激活。
5. 蛋白质转移后，用超纯水清洗印迹，以消除残留杂物。
▎LeanV PVDF转印膜选购指南
由于蛋白质性质的变化，如电荷密度、构象和疏水性，并不是所有的蛋白质都有相同的膜表面行为。可能需要对各种LeanV PVDF转印膜进行实验针对您的特定应用程序优化结果。下表提供了为特异性蛋白质印迹后应用的PVDF膜选择：
| 成分 | PVDF |
一般免疫检测 氨基酸分析 低丰度或小分子量蛋白免疫检测 低丰度或小分子量蛋白测序 | LeanV PVDF 0.45μm (货号：PA45) LeanV PVDF 0.45μm (货号：PA45) LeanV PVDF 0.2μm (货号：PA22) LeanV PVDF 0.2μm (货号：PA22) |
▎注意事项 ：
1. 操作取膜裁膜时一定要戴手套，以免留下指纹。
2. 小心操作，避免划伤薄膜表面，不要折叠膜; 使用钝镊子，以防损坏薄膜。
3. 在切割或处理过程中，保留与薄膜一起的保护纸（蓝纸），但在润湿膜时应丢弃。
4. 疏水性膜（LeanV PVDF）在使用前必须在醇溶液中激活。
5. 蛋白质转移后，用超纯水清洗印迹，以消除残留杂物。
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