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LeanV One Step Cloning Kit

【无缝克隆】

目录号：K131

LeanV One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆的试剂盒，可以将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组，50℃反应10 - 30 min即可进行连接，适用于快速克隆, DNA定点突变等。

价 格 ￥750

LeanV One Step Cloning Kit

￥750

K131-50rxns

¥ 750

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产品描述 使用说明 FAQ 说明书下载 引用文献

▎产品简介 ：


LeanV One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆的试剂盒，可以将插入片段定向克隆至 任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组，50℃反应10 - 30 min即可进行连接，适用于快速 克隆，DNA定点突变等。


▎产品组分 ：


组分K131-20rxnsK131-50rxns

2 x LeanV One Step Cloning Mix 

700bp Control Insert (10ng/μL)

pCold Control Vector,linearized(20ng/μL)

100 μL 

5 μL

10 μL

250 μL

5 μL

10 μL

▎适用范围 ：

本产品适用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆、DNA定点突变


▎产品优势 ：


高成功率：轻松准确扩出目的条带
结果分析方便：本产品中含有电泳指示剂，PCR反应结束后可直接进行电泳分析

操作便捷：加入引物和模板即可进行扩增，减少实验操作的步骤

▎储存条件 ：

 - 30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。



▎实验流程 ：

1. 制备线性化载体

选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。选择载体线性化方式限制性内切酶酶切消化或反向PCR扩增。

  • 酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切线性化, 若使用单酶切线性化，请适当延长酶切时间以减少环状质粒残留，降低转化背景。
  • 反向PCR扩增制备线性化载体，推荐使用高保真DNA聚合酶进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR产物需要进行胶回收，减少环状质粒环状DNA模板的残留。

2. 制备插入片段

通过在插入片段正、反向引物5‘ 端引入15-25bp线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’ 端和3‘ 端的末端分别带有与线性化载体的两个末端对应的完全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成扩增，获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收正确的产物片段。

  •   插入片段正向扩增引物设计方式：

  5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列-3’

  •   插入片段反向扩增引物设计方式：

3’-基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点（保留或删除）+下游载体末端同源序列-5’。

3. 线性化载体与插入片段浓度测定

使用NanoDrop或Qubit检测线性化载体和插入片段的浓度。

4. 配制重组反应体系

1）线性化载体和插入片段使用量计算

载体与插入片段摩尔比为1:2 ~ 1:3；当插入片段长度大于克隆载体时，将插入片段当作克隆载体，克隆载体当作插入片段计算。

2）在冰上配制反应体系：

试剂组分

实验组阴性对照阳性对照

线性化载体

插入片段

2 x LeanV One Step Cloning Mix

DNase-free Water

X

Y

5 μL

up to 10 μL

X

0

0

up to 10 μL

pUC19 Control Vector, linearized 1μL

700bp Control Insert 1 μL

5 μL

up to 10 μL

3） 使用移液器轻轻吸打混匀并瞬时离心。

4） 50℃反应20min， 4℃维持或取出后置于冰上冷却。

5） 重组反应转化、涂板，具体方法参照感受态细胞的说明书。


▎注意事项 ：


1. 请于使用前确保产品完全解冻，彻底混匀后短暂离心，置于冰上备用。 

2. 反复冻融会影响产品的性能。 

3. 为了提高扩增成功率和产量，请使用高质量的模板。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。


►引物如何设计？ 

 ①载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切、反向PCR，优先选择双酶切。 

 ②样品裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放引物三部分：同源臂(15 - 20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含 量40% - 60%)+酶切位点(根据实验需求保留或者删除)+特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。

 

►多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段 

①PCR 产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。 

②克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切 反应时间、胶回收纯化酶切产物。

③反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐DpnI消化， 或者对扩增产物进行胶回收纯化。 


►菌落PCR无条带 

①引物不正确。 

②CR 体系或程序不合适。 

③重组失败，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。 


►平板上未长出克隆或克隆数目很少 

①引物不正确。

②载体和插入片段的使用量不足，或者不纯。 

③超过感受态细胞体积的1/10，降低了转化效率, 建议选择克隆用感受态细胞。

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产品描述

▎产品简介 ：


LeanV One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆的试剂盒，可以将插入片段定向克隆至 任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组，50℃反应10 - 30 min即可进行连接，适用于快速 克隆，DNA定点突变等。


▎产品组分 ：


组分K131-20rxnsK131-50rxns

2 x LeanV One Step Cloning Mix 

700bp Control Insert (10ng/μL)

pCold Control Vector,linearized(20ng/μL)

100 μL 

5 μL

10 μL

250 μL

5 μL

10 μL

▎适用范围 ：

本产品适用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆、DNA定点突变


▎产品优势 ：


高成功率：轻松准确扩出目的条带
结果分析方便：本产品中含有电泳指示剂，PCR反应结束后可直接进行电泳分析

操作便捷：加入引物和模板即可进行扩增，减少实验操作的步骤

▎储存条件 ：

 - 30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。



使用说明

▎实验流程 ：

1. 制备线性化载体

选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。选择载体线性化方式限制性内切酶酶切消化或反向PCR扩增。

  • 酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切线性化, 若使用单酶切线性化，请适当延长酶切时间以减少环状质粒残留，降低转化背景。
  • 反向PCR扩增制备线性化载体，推荐使用高保真DNA聚合酶进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR产物需要进行胶回收，减少环状质粒环状DNA模板的残留。

2. 制备插入片段

通过在插入片段正、反向引物5‘ 端引入15-25bp线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’ 端和3‘ 端的末端分别带有与线性化载体的两个末端对应的完全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成扩增，获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收正确的产物片段。

  •   插入片段正向扩增引物设计方式：

  5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列-3’

  •   插入片段反向扩增引物设计方式：

3’-基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点（保留或删除）+下游载体末端同源序列-5’。

3. 线性化载体与插入片段浓度测定

使用NanoDrop或Qubit检测线性化载体和插入片段的浓度。

4. 配制重组反应体系

1）线性化载体和插入片段使用量计算

载体与插入片段摩尔比为1:2 ~ 1:3；当插入片段长度大于克隆载体时，将插入片段当作克隆载体，克隆载体当作插入片段计算。

2）在冰上配制反应体系：

试剂组分

实验组阴性对照阳性对照

线性化载体

插入片段

2 x LeanV One Step Cloning Mix

DNase-free Water

X

Y

5 μL

up to 10 μL

X

0

0

up to 10 μL

pUC19 Control Vector, linearized 1μL

700bp Control Insert 1 μL

5 μL

up to 10 μL

3） 使用移液器轻轻吸打混匀并瞬时离心。

4） 50℃反应20min， 4℃维持或取出后置于冰上冷却。

5） 重组反应转化、涂板，具体方法参照感受态细胞的说明书。


▎注意事项 ：


1. 请于使用前确保产品完全解冻，彻底混匀后短暂离心，置于冰上备用。 

2. 反复冻融会影响产品的性能。 

3. 为了提高扩增成功率和产量，请使用高质量的模板。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。


FAQ

►引物如何设计？ 

 ①载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切、反向PCR，优先选择双酶切。 

 ②样品裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放引物三部分：同源臂(15 - 20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含 量40% - 60%)+酶切位点(根据实验需求保留或者删除)+特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。

 

►多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段 

①PCR 产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。 

②克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切 反应时间、胶回收纯化酶切产物。

③反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐DpnI消化， 或者对扩增产物进行胶回收纯化。 


►菌落PCR无条带 

①引物不正确。 

②CR 体系或程序不合适。 

③重组失败，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。 


►平板上未长出克隆或克隆数目很少 

①引物不正确。

②载体和插入片段的使用量不足，或者不纯。 

③超过感受态细胞体积的1/10，降低了转化效率, 建议选择克隆用感受态细胞。

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引用文献
LeanV One Step Cloning Kit
目录号：K131

LeanV One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆的试剂盒，可以将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组，50℃反应10 - 30 min即可进行连接，适用于快速克隆, DNA定点突变等。
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