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WESTERN BLOT

蛋白小分子保镖--蛋白酶抑制剂篇

做Western Blot的小伙伴们大概都有过这样的崩溃时刻：蛋白提取过程没有问题，一到上样条带却弥散、拖尾、甚至直接消失——很多时候，罪魁祸首不是抗体，而是你的蛋白在裂解的那一刻就被'自己人'降解了。

今天就来聊聊WB实验里最容易被忽视、却又至关重要的一步：蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor）。

WESTERN BLOT

为什么蛋白样本必须加蛋白酶抑制剂

细胞是一个高度区室化的体系。完整细胞中，各类蛋白酶被严格限定于溶酶体等特定结构内，其活性受到精密调控。然而，一旦细胞被裂解，区室屏障随之瓦解，丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶与金属蛋白酶被同时释放，并在失去调控的环境中对暴露的蛋白底物进行无差别切割。目标蛋白的降解，自裂解开始的那一刻便已启动。

不加的后果包括：

目标条带变弱或消失（完全降解）
出现非特异杂带（部分降解产物被抗体识别）
重复性差（降解程度随机，每批结果都不一样）

所以：裂解液里不加蛋白酶抑制剂 ≈ 白做

常用蛋白酶抑制剂分类

实验小Tips：对于常规 Western Blot 实验，商品化蛋白酶抑制剂混合液是目前最为稳妥的选择，比如联纬生物产品（WY211）Protease Inhibitor Cocktail (100X)就是一款通用型的蛋白酶抑制剂混合液。

蛋白酶抑制剂如何使用

加入时机。抑制剂应于临用前新鲜加入裂解液，而非预先配制后长期存放。多数抑制剂在水溶液中稳定性有限，PMSF 尤为敏感，提前配制将显著降低有效浓度。
工作浓度。严格遵循说明书推荐比例稀释（常见为 100× 储液按 1∶100 加入），浓度过低则保护不足，过高则可能引入非必要干扰。
温度控制。裂解、离心与分装全程于冰上或 4 ℃ 环境中进行，低温与抑制剂协同作用，才能将降解降至最低。
即用即弃。已加入抑制剂的裂解液应尽快使用完毕；存放后的残余裂解液，其抑制剂活性已不可依赖。

实验常见问题

问题1：误把磷酸酶抑制剂当成蛋白酶抑制剂

磷酸酶和蛋白酶抑制剂是不同的抑制剂，一般的蛋白检测只需加蛋白酶抑制剂，但在做磷酸化蛋白检测时，两类都要加——蛋白酶抑制剂防降解，磷酸酶抑制剂（如NaF、Na₃VO₄、Cocktail）防去磷酸化，功能完全不同，缺一不可。

问题2：忽视EDTA的兼容性问题

若下游涉及金属依赖性实验（如 Co²⁺ 亲和纯化、部分激酶活性测定），应选用不含 EDTA（EDTA-free）的抑制剂配方。

问题3：'上次的裂解液还剩半管，直接用了'

裂解液加好抑制剂后建议尽快用完。抑制剂失效的裂解液 ≈ 没有抑制剂。

问题4：对特殊样本掉以轻心

针对组织样本、分泌类样本、反复冻融的样本，蛋白酶活性往往更高，必要时可加倍用量或联合多种抑制剂，并尽量减少冻融次数。

问题5：只关注加抑制剂却忽略使用温度

抑制剂并非万能，室温放置的样本仍会快速降解。规范操作的要义可概括为三点：低温、快速、全程有抑制剂。

联纬生物产品

WY211

蛋白酶抑制剂混合物

Protease Inhibitor Cocktail (100X) 是一种通用型的蛋白酶抑制剂，包含 AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin, Pepstatin A 等组分，并单独提供 0.1M EDTA，供选择使用。

产品优势：

 广谱高效：多种抑制剂组合，覆盖动物/植物/酵母/细菌样品。

 灵活兼容：可选加 EDTA，不干扰后续定量及 WB、Co-IP 等实验。

 使用便捷：100X 浓缩液，按 1:100 直接添加，且可适当分装保存，避免反复冻融。

WY212

磷酸酶抑制剂混合物

Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)是一款增强版广谱型磷酸酶抑制剂，可有效抑制丝氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶和苏氨酸磷酸酶，以及酸性磷酸酶、碱性磷酸酶等细胞内常见的磷酸酶。

产品优势：

 广谱高效：7 种抑制剂科学配比，覆盖常见磷酸酶类型。

 兼容性强：与蛋白定量（BCA 法）, WB, Co-IP, pull-down 等下游应用完全兼容。

 使用便捷：100X 浓缩液，按 1:100 直接添加，且可适当分装保存，避免反复冻融。

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