DNA pull down立功—以DNA为诱饵高通量筛选转录因子的案例解析

2023年6月28日，中国农业科学院作物科学研究所，国家小麦改良中心的曹双河团队（谢丽娜为第一作者）在Plant Biotechnol J杂志（13.8分，中科院1区）发表了题为“Efficient proteome-wide identification of transcription factors targeting Glu-1: A case study for functional validation of TaB3-2A1 in wheat”的研究论文。研究人员首次在小麦中利用DNA pull down联合LC/MS质谱分析平台，高通量筛选并鉴定了31个与CCRM-1相互作用的TFs，并通过酵母单杂交（Y1H）及凝胶电泳迁移（EMSA）实验明确了TaB3-2A1与CCRM-1的结合，并通过表型研究分析了TaB3-2A1对淀粉含量，氮调节平衡的作用以及对抽穗期、株高、粒重等作物性状的影响。为系统解析小麦种子发育和质量产量的调节提供了充足的遗传资源。

小麦 ( Triticum aestivum L.) 是全世界约 35% 人的主食来源。小麦面团独特的加工特性归因于其由种子储存蛋白（SSP）决定的弹性和延展性。高分子量麦谷蛋白亚基 (HMW-GS) 是 SSP 的主要成分，在很大程度上决定了小麦面团的弹性和强度，HMW-GS 的定量和定性差异解释了高达 70% 的加工质量差异。HMW-GS由小麦同源1组染色体中的GLU-1位点编码，尽管已经鉴定了一些调节Glu-1基因转录的转录因子和顺式元件，但其潜在的调节机制在很大程度上是未知的。

作者前期工作定义了Glu-1启动子上保守的顺式调节模块（CCRM），并在功能上证实所有 CCRM 对Glu-1的表达有显著影响，使用CCRM 作为“诱饵”进行了酵母单杂交 (Y1H) 文库筛选，仅检测到两个 TF 与 CCRM 结合[1]。在本文中，作者首次在小麦作物中以DNA Pull-down 联合液相色谱-质谱 (LC-MS) 平台，鉴定更多与 CCRM1-1 结合的候选转录因子，以此阐明决定Glu-1时空表达的不可或缺的顺式调节模块，更高效地针对Glu-1 具有转录调控作用的TFs进行筛选和鉴定，更系统地剖析高度活跃的胚乳特异性表达的调控转录机制。

通过制备Glu-1Dx2启动子中的 CCRM1-1（起始密码子上游 208 至 101 bp）模块的探针，从花后 10 天 (dpa) 发育的籽粒核蛋白中拉下调节Glu-1的 TFs，共鉴定到385个pull down组特有蛋白，根据基因注释信息，发现其中有118个转录效应因子，包括31个TFs，34个TF伴侣分子，18个转录起始或延伸因子，35个表观遗传修饰因子，表明Glu-1的表达受到多层次因子的转录调控。并通过PLACE、Wheat Expression Browser数据库分析TFs对应的DNA基序和表达模式。其中，这35个转录因子分布的亚家族中，含有B3结构域的蛋白最为常见，因此作者关注到TaB3-2A1、 TaB3-2B1和TaB3-2D1，用于后续的验证实验。

总之，本研究中，作者利用DNA pull down联合LC/MS技术成功鉴定了一组Glu-1结合的转录调控因子，为深入剖析Glu-1表达背后的转录调控机制提供了重要的参考依据和遗传资源。

长期以来，利用酵母单杂交（Y1H）筛选与启动子或顺式作用元件交互的转录因子是最为成熟的技术，在植物转录调控领域具有举足轻重的地位。然而由于酵母系统的局限性，不少小伙伴困扰于自激活和假阳性。孙子兵法有云，势者，因利而制权也，告诉我们有必要因时因事而异而变通方法。就像作者经历的，在利用小麦发育中谷物制备的Y1H文库中，未捕捉到任何TF[1]，而在此研究中利用DNA pull down技术进行的探索，无疑是柳暗花明。

DNA pull down立功—以DNA为诱饵高通量筛选转录因子的案例解析

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