蛋白临近标记扛大梁—平均影响因子35+，CNS群英荟萃，为您分子互作研究梳理实验设计思路

众所周知，蛋白质是生命活动的执行者，但是生命活动的各项行为并不是由单一蛋白质来完成的，它们经常形成稳定或动态的、短暂的蛋白-蛋白相互作用、组装和互作网络，并与DNA和RNA有密切的相互作用。异常的蛋白和蛋白、蛋白和核酸分子之间的相互作用是导致严重疾病和紊乱的原因，这些网络相互作用是基本生物过程或疾病进程的分子生物学基础,在细胞功能中起着重要作用。

蛋白临近标记技术结合质谱已成为分子水平剖析复杂细胞网络的强有力工具[1]。

一方面，通过临近标记联合定量的质谱分析量化未知互作的强度[2]，用于筛选胁迫反应蛋白，或药物（毒物，代谢产物，小分子化合物，病原微生物）反应，蛋白之间动态的分子互作场景[3]，以及翻译后修饰酶-底物互作场景，为动植物，微生物的蛋白蛋白相互作用（PPI）提供比生物信息学预测或传统AP-MS更为有价值的参考[4][5]。另一方面，可利用临近标记酶开发的工具细胞或工具鼠，对亚细胞器及细胞细胞之间的转运蛋白进行标记[2][5]，绘制活细胞中内源蛋白转运的图谱，解决“贫僧从哪里来，到哪里去”的科学问题，或利用Cre驱动的细胞特异性工具鼠，识别特定的器官或细胞类型与其他器官通讯分泌物介质的筛选和图谱绘制，探究细胞-器官，器官-器官交互[6]。随着单细胞测序技术（SCRA-SEQ）的日益成熟，提供了大量细胞-细胞间交互作用的算法和预测信息，然而基于临近标记的化学生物学工具是识别和发现这些相互作用的技术手段[2][5][7]。

基于以上常见的Case，利用临近标记酶追踪蛋白动态互作底物筛选的策略以及实验设计路线，小编根据不同研究目的和预期冲击杂志的水平，进行以下汇总，期望对正在或即将进入分子机制研究的科研人员提供参考和思路储备。

Idea 1. 筛选并鉴定与兴趣蛋白的互作伙伴（定性，3区+2区）

此类实验目的类似于传统AP-MS，利用生物素标记酶如TurboID，miniTurboID，APEX2，构建融合目的蛋白的表达载体，以空的生物素标记酶载体为对照，分别转染（或慢病毒感染，或农杆菌侵染）至目的细胞，以生物素为底物进行化学标记临近蛋白，利用链霉亲和素磁珠富集并下拉被生物素标记的临近蛋白，利用高分辨质谱仪对下拉蛋白进行鉴定，通过蛋白信息注释，GO/KEGG分析了解下拉蛋白概况，利用PPI互作网络分析已知互作蛋白。

Idea 2. 筛选并鉴定响应条件刺激的差异PPI（定量，2区+1区）

此类研究，需明确某个靶点A，在响应某种刺激时候A的作用是极其重要的，此时即可以A蛋白为诱饵，构建与生物素标记酶融合表达载体，分别设置实验组（条件处理可以是某种应激，刺激，药物，毒物，外源蛋白，过表达/干扰某个基因等），对照组为条件处理对应的对照。每组均将A融合表达的标记酶载体转染（或慢病毒感染，或农杆菌侵染）至目的细胞，设置3v3生物学重复，以生物素为底物进行化学标记临近蛋白，利用链霉亲和素磁珠富集并下拉被生物素标记的临近蛋白，利用高分辨质谱仪对下拉蛋白进行定量分析，通过对独有/差异蛋白信息注释，GO/KEGG分析了解组间蛋白差异，利用PPI互作网络分析已知互作蛋白。

Idea 3. 分泌组学筛选器官通讯介质（定量，1区）

将TurboID载体N端融合Sec61b内质网跨膜信号亚基信号，允许标记酶将通过内质网分泌至微环境中的介质蛋白进行生物素化标记，而后利用转染（或AAV病毒感染，或农杆菌侵染）至目的细胞（或器官），设置实验组，对照组。而后体外或体内补充生物素后，根据实验目的，从细胞上清或循环血浆，亦或从靶器官中中监测生物素标记的分泌蛋白。进行利用质谱定量分泌介质的差异表达情况，并通过生物信息学分析某种模型或刺激对分泌介质的影响，以及靶器官中分泌介质的差异表达情况。

Idea 4. 亚细胞器转运介质的筛选及鉴定（定量，1区）

利用两种不同标记酶TurboID及APEX2作为通讯介质来源地和目的地不同标记信号，将利用亚细胞定位信号A融合的TurboID标记来源细胞器的蛋白，利用亚细胞定位信号B融合的APEX2标记目的地细胞器的蛋白，而后将两质粒共转染至细胞，或稳定表达株，设置实验组及对照组，各组均按照起点→目的地的顺序，添加TurboID标记酶底物生物素，停止标记后等待特定时间，再利用APEX2标记酶底物炔基苯酚，再添加叠氮基标记的荧光素，利用Cu催化的Click点击反应使荧光素偶联至炔基苯酚标记的蛋白上。这种情况下，同时带有生物素和炔基两种修饰的蛋白，即是从起始点A到目的地B的蛋白。而后分别利用链霉亲和素富集，和荧光素抗体富集的蛋白，LC-MS分析两种方式富集的蛋白，对两种方式富集到的共有蛋白进行差异分析，以及后续的生物信息学分析。

再强大的技术，也是有自己的短板的，目前临近标记技术最大的局限性在于，需要将兴趣蛋白，利用转基因技术，或者转化（转染）至目的细胞或植株，某些物种或细胞难以转染，是限制临近标记技术应用的一个绊脚石。当然，以上总结，也仅仅是临近标记技术在揭示蛋白动态调节网络中应用的冰山一角，也期望临近标记技术能够成为您科研方案里的顶梁柱。

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