教科书式的，照搬就行——解读20+肺癌多西他赛耐药机制新高度

2023年3月，上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤科陈东芹团队在Drug Resist Updates杂志（IF：24.30，中科院一区）发表了题为“Exosomal LOC85009 inhibits docetaxel resistance in lung adenocarcinoma through regulating ATG5-induced autophagy”的研究论文。DTX是一种紫杉醇类衍生物，其可以抑制细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡，是LUAD患者的常用化疗药物之一。然而耐药的出现限制了DTX在LUAD患者中的应用。研究人员发现来自肺腺癌（LUAD）细胞的外泌体LOC85009通过隔离泛素特异性蛋白酶USP5来破坏转录因子USF1的稳定，因而抑制自噬相关基因ATG5的转录及LUAD细胞的自噬，进而增强了多西他赛（DTX）耐药LUAD细胞对DTX的敏感性。该研究中，研究人员利用RNA pull down/DNA pull down技术联合LC/MS质谱分析，并结合翻译后修饰，深入探讨了USP5/USF1轴调节ATG5诱导自噬的分子机理，为LUAD的DTX耐药机理提供了新的见解。

作者首先证实了LOC85009抑制了LUAD细胞的DTX抗性及细胞增殖并促进了LUAD细胞凋亡。自噬进程在包括LUAD在内的肿瘤的化疗耐药中发挥关键作用，通过检测自噬标志物的水平及拯救实验，作者证实了LOC85009通过下调ATG5水平抑制LUAD-DTX耐药细胞的自噬。

机理方面，作者通过ATG5启动子DNA-pull down联合LC/MS质谱分析，筛选到5个潜在的ATG5启动子结合蛋白。通过表达调控实验作者锁定了转录因子USF1，进一步通过DNA pull down-WB实验、双荧光素酶报告实验及Chip-qPCR/PCR验证，作者证实了USF1是结合并调节ATG5基因表达的转录因子。

作者继续探究了LOC85009对转录因子USF1的表达调控及相互作用，发现LOC85009过表达虽然不影响USF1的mRNA水平，却增加了USF1的泛素化并降低了其稳定性。然而RIP实验结果显示USF1与LOC85009并无相互作用。作者推测LOC85009可能以间接的方式促进了USF1的泛素化及降解。通过RNA pull down实验联合LC/MS质谱分析，作者筛选到LOC85009的下游蛋白泛素特异性蛋白酶USP5并进一步通过RIP实验联合琼脂糖凝胶电泳验证了LOC85009和USP5的互作。USP5是USP家族的一员，其通过去泛素化调控靶蛋白的稳定性。IP-WB结果证实了USP5过表达抑制了USF1的泛素化，上调了USF1的蛋白水平。进一步的Co-IP实验发现LOC85009以剂量依赖性的方式抑制了USP5与USF1的互作，降低了USF1的泛素化水平。

在发现LOC85009与USF1无直接相互作用时，作者采用RNA pull down技术突破瓶颈，转而寻找LOC85009的结合蛋白。该部分的峰回路转，无疑是本篇文章思路方面最大的亮点。

总之，在本研究中，作者综合运用了围绕中心法则的转录调控、转录后调控、翻译后修饰角度，打通了LOC85009调控的USP5/USF1/ATG5通路，得出结论外泌体LOC85009通过USP5/USF1轴调控ATG5诱导的自噬进而抑制DTX耐药的作用机制。

RNA pull down是以感兴趣的RNA为中心，筛选或检测与该RNA结合的蛋白质的技术。作为检测目的RNA与其结合蛋白相互作用的主要技术之一，其帮助科研人员了解调节RNA命运的分子机制，解析RNA与蛋白质之间的相互作用网络。一方面，RNA可以通过与蛋白相互作用或调控RBP的活性及定位等影响RBP下游事件；另一方面，RBP又参与了RNA的合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程，调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程。总之，锁定有生物学功能的目的RNA后，RNA-pull down联合质谱分析可以高效挖掘下游RBP，帮助打开科研思路，突破科研瓶颈。

教科书式的，照搬就行——解读20+肺癌多西他赛耐药机制新高度

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