▎使用方法：
试剂准备
1. Lysis Buffer 临用前配制，内含不溶物，摇匀后使用，用去离子水将 Lysis Buffer (5×) 稀释 5 倍得到 Lysis Buffer，溶液-20℃保存。
2. Firefly Luciferase Solution 临用前配制，用 Firefly Luciferase Assay Buffer 溶解 Firefly Luciferase Substrate，然后将其全部加入 Firefly Luciferase Assay Buffer 瓶中，充分混匀后按 使用需求分装，避光保存于-80℃。
注意：Firefly Luciferase Solution 不能反复冻融，建议按单次使用量分装成小规格，-20℃避光保 存，推荐 3 个月内使用，-80℃避光保存，12 个月内有效。
3. Renilla Luciferase Solution 临用前配制，根据实际使用量，以 50:1 的比例将适量的 Renilla Luciferase Assay Buffer 和 Renilla Luciferase Substrate (50×) 混匀。
注意：Renilla Luciferase Solution 需现配，Renilla Luciferase Substrate (50×) 溶解于无水乙 醇中，使用前需瞬时离心至管底，小心量取管内溶液体积，如发现液体体积有明显减少，请加入无 水乙醇补足体积后保存。
实验步骤
样本制备
1. 细胞样本
(1) 在合适的孔板上培养细胞后进行转染并用适当的方法处理细胞。
(2) 将培养基移除，加 PBS 轻轻洗涤细胞 2 次（贴壁细胞进行此操作，悬浮细胞可直接离心收集 细胞），吸弃 PBS，按如下方案加入 Lysis Buffer。
| 试剂 | 96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板
| 6孔板 |
Lysis Buffer (μL) |
100 | 150 | 200 | 300 | 500 |
注意：Lysis Buffer 使用前摇匀，如荧光素酶的表达水平较低，可适当减少 Lysis Buffer 用量，如 24 孔板每孔加入 100 μL，6 孔板每孔加入 200 μL。
(3) 细胞置于摇床上震荡 5-10 min，充分裂解细胞。
(4) 将细胞裂解产物 10000 rpm 离心 2 min，取上清用于检测。
2. 原生质体（仅供参考）
(1) 制备原生质体，并将相应的质粒转化原生质体。
(2) 16-24 h 后离心收集 2×10 5原生质体，加入 200 μL 的 Lysis Buffer。
(3) 室温孵育 5-10 min，充分裂解原生质体。
(4) 将原生质体裂解产物 10000 rpm 离心 2 min，取上清用于检测。
3. 植物叶片（仅供参考）
(1) 将含相应质粒的农杆菌注射植物叶片。
(2) 注射 2 天后取约 1 cm2的叶片加入 500 μL Lysis Buffer，匀浆器研磨后 10000 rpm 离心 2 min， 取上清用于检测。
注意：细胞裂解后可立即检测荧光素酶活性，也可以冻存，需要时再进行检测，冻存样品需融解至 室温再进行检测。
实验检测
1. 小心吸取 20-100 µL 细胞裂解上清（如果样品量足够，请加入 100 µL，如果样品量不足可以适 当减少用量，但同批样品的使用量应保持一致）至检测管或 96 孔全黑/全白酶标板中，将 100 µL 平 衡至室温的 Firefly Luciferase Solution 加入检测管或酶标板中，迅速混匀后，立即于发光检测仪 或多功能酶标仪中检测 Firefly Luciferase 报告基因活性。
2. 在以上反应液中加入 100 µL 新鲜配制的 Renilla Luciferase Solution，迅速混匀后立即于发光 检测仪或多功能酶标仪中检测 Renilla Luciferase 报告基因活性。
▎注意事项 ：
1. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行检测。较高的温度 会导致信号强度增加，但信号稳定性较低，因此建议操作环境温度不超过 25℃。
2. 高活性的荧光素酶能够更快速地催化底物发光，产生大量的光信号。然而，这种快速反应往往 会导致发光信号的半衰期缩短。
3. 为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，每个样品和测定试剂混合后到测定前的 时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好， 然后统一加入 Firefly Luciferase Solution。
4. 检测时需使用全黑色或白色的 96 孔板，防止相邻孔的干扰。
5. 萤火虫荧光素酶催化生物发光最强波长为 560 nm，海肾荧光素酶催化生物发光最强波长为 480 nm。
6. Renilla Luciferase Substrate 易挥发，注意密封保存。
7. 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。
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