Q1：扩增效率低，无扩增条带或条带亮度不够。
A1：(1) 检查引物是否降解，设计是否合理。
(2) 检查模板是否断裂、开环或降解；模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开；模板为粗品，存在抑制物，建议降低模板浓度；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 检查反应所用的酶是否失活。
(4) 检查扩增体系是否配制错误，建议重复实验。
(5) 检查反应程序是否有误。
Q2：扩增特异性差，非特异性扩增。
A2：(1) 检查引物设计是否准确。
(2) 检查模板是否不纯，降解, 过量, 或被污染。
(3) 检查反应程序是否合适, 如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
Q3：扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A3：(1) 确保制胶时要使胶完全融化。
(2) 检查引物是否降解。
(3) 检查模板是否降解或过量, 若模板是cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度，逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(4) 检查反应程序是否合适。
Q4：空白对照出现扩增产物。
A4：(1) 引物设计不合理, 扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染, 需更换新的Mix、水或引物重复实验。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
Q5：高保真酶扩增保真性差，存在突变。
A5：(1) 模板本身存在突变, 检查模板，若模板是质粒，建议送质粒去测序；若模板是cDNA，建议重复实验，如果仍有突变，可能是cDNA有问题，建议重新制备cDNA，制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。
(2) 模板长时间在紫外光下照射，引入突变; 切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。
(3) 基因序列与NCBI上的不一致，建议再重复一次送去测序，若结果和上一次一样，说明序列可能和NCBI上的不一致。
(4) 少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。
Q6：逆转录后的产物cDNA作为模板，使用高保真酶，一次应该加多少体积？
A6：说明书建议cDNA模板使用量为1-5μl（不超过PCR反应总体积的1/10），可在这个范围内尝试不同的使用量，摸索合适使用量。
Q7：带颜色的PCR产物是否影响酶切效果？
A7：经测试，带颜色的PCR产物不会影响酶切效果。
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